C'est dans son édifice actuel que furent regroupées, dès 1836, les diverses collections qui constituent le patrimoine de ce musée, de celles, tout particulièrement importantes, des Wittelsbach à celles des Zweibrücken et des Boisserée, auxquelles s'ajouteront, au début de XIXème siècle, les biens confisqués aux ordres religieux.
La présence des artistes germaniques est extrêmement significative de ce musée, de l'Autrichien Pacher à Grünewald, Altdorfer avec sa célèbre Bataille d'Alexandre, Dürer, brillamment représenté par des œuvres telles que l'Autoportrait ou encore la Déploration sur le Christ mort, Cranach l'Ancien avec la Crucifixion.
Les collections d'art hollandais ( Rembrandt, Steen, Cuyp ) et flamand sont elles aussi très riches, avec de nombreux chefs-d’œuvre de Rubens et de Van Dych. La qualité des œuvres italiennes est également remarquable : les Pietà de Fra Angelico et de Boticelli, la Vierge de l'Annonciation d'Antonello de Messine, Le Christ chez Marthe et Marie de Tintoret.
Il convient enfin de signaler les œuvres de Ribera et de Zurbaran, de même que celle des classiques français Poussin et Lorrain.